LC

• 1 Az LC
• 2 A mézes LC készítése lépésekben
  • 2.1 Vákuum
  • 2.2 Karamellizáció
  • 2.3 Lehetőségek
  • 2.4 Inkubacio, gondozas
• 3 Fertőzések
• 4 Mester kultúrák
• 5 LC készítése spawnból vagy sütiből
• 6 Segédlet
• 7 Forrasok

A folyadékban élő gombakultúrák (angolul Liquid Culture, LC) alkalmazásával,

• nagyon kis mennyiségű spóraporból (gyakorlatilag pár szem spórából)
• spórás vízből (egy csepp töredékéből)
• egy termőtest, vagy akár micélium darabkából (tűfej nagyságúból)
• vagy egy előző LC-ből

pár nap alatt literekben mérhető oltóanyagot lehet létrehozni, ami ráadásul majdnem kétszer olyan gyorsan szövi be a táptalaját , mint a hagyományos oltóanyag, a spórásvíz.

Ezért érdemes a megmaradt spórásvizet, maradék printet, -bármilyen kevéske is legyen- LC beoltására használni.

Mégegy teljesen kiürült fecskendő is alkalmas erre.

Csinálni kell egy LC-nek való tápoldatot a lentebb leírt módszerek valamelyikével, például egy kis befőttesüvegbe, lehetőleg szilikon port-tal.

A kimerült fecskendőt csak meg kell szívni a tápoldattal, és ugyanazzal a lendülettel vissza is lehet fecskendezni bele. Így gyakorlatilag kimosódott a fecskendőből az a pár szem spóra, ami még pont elég lesz egy LC beindításához. Ez főleg a 3 részes fecskendőknél működik, a két részes tartálya miután kiürült, nagyobb esélyjel fertőződhet el, mivel a hátulja teljesen nyitott, de ha kiürülése után azonnal használatra kerülnek nagy az esély a sikerre.

Néhány cég fiolákat árul fecskendők helyett, ezeket még egyszerűbben újra lehet hígítani és LC vagy akár egy süti beoltásra felhasználni.
Mivel a hallucinogén gombák és spóráinak legális forgalmazása már Hollandiában is tiltó listára került, minden lehetőséget érdemes kihasználni tovább szaporításukra.

Az ipari gombatermesztésben régóta használatban van egy hasonló technika, de mostanra egyszerűsödött le annyira, hogy bárki otthoni körülmények között, a háztartásban is megtalálható alapanyagokból saját maga is elő tudja állítani.
Röviden:

A gomba egy darabja (ami lehet spórapor, spórás víz, micélium ,vagy akár termőtest darabka) tápoldatos vízbe kerülve fejlődésbe kezd, több kis bolyhos kolóniát fejlesztve. Ha a kolóniákat több kisebb darabra aprítjuk, akkor minden egyes kis darab új apró bolyhos kolóniát képez, rengeteg oltóanyaghoz juttatva ezzel a termesztőt.
Előnyei:

• Mivel ez már aktív, élő micélium, az ilyen oldattal oltott táptalaj kb fele annyi idő alatt kolonizálódik, mintha például spórával lett volna beoltva.
• gyorsan fejlődik, 1 ml spóraoldatból pár nap alatt több liter LC-t lehet készíteni.
• A több ezer vízben úszkáló micélium darabka pedig rengeteg oltási pontot biztosít. Ezenkívül
• a spórákkal ellentétben elviseli a H2O2-t, így akár magát az LC-t, akár a leendő táptalajt is elő lehet kezelni vele.

Hátránya

• Az LC-n nehéz észrevenni ha elfertőződött, ez csak akkor derül ki 100 %-osan, ha az összes vele beoltott táptalaj elfertőződik. Persze ilyenkor ki kell zárni például a táptalaj elégtelen sterilizálásából adódó, vagy oltáskor bejutott fertőzéseket.

Az oldatban a tápanyagot általában ezek valamelyike szolgáltatja:

• méz (lehetőleg tiszta, organikus méz. Jól működik, de zavarossága és sárgás színe miatt nehéz rajta észrevenni ha esetleg elfertőződött )
• dextróz=glükóz=szőlőcukor (lassan indul növekedésnek benne a micélium(több hét is lehet), de a nagy előnye az hogy oldata teljesen átlátszó, így könnyebb észrevenni ha elfertőződött)
• “Karo” szirup (Magyarországon nem kapható, egyébként kukorica szirup és vanília kivonat)
• kristálycukor, barna cukor és más cukrok is beválhatnak, általában egymással keverve, egymást kiegészítve, de az előző hármat használják a leggyakrabban és a legnagyobb sikerrel is.
• bio nádcukor (4%-os oldat; kuktázható; a micélium bolyhok 2-3 nap után megjelennek)

Ezek egyikéből kell egy 4%-os oldatot készíteni, lehetőleg desztillált vagy ioncserélt vízzel. A 4%-ot nem nehéz kimérni, ugyanis ez 1 teáskanál méz vagy dextróz 1 dl vízhez.
Inkább legyen túl híg az oldat, ez legfeljebb kisebb mennyiségű gombakultúra fejlődéséhez vezethet a tápanyagok hiánya miatt, viszont ha túl sűrű inkább tartósítani fog, mint tápanyagul szolgálni. 1%, 2% -os eltérés persze még nem számít annyira.
A beoltás után méz esetében 1-3 nappal már látható a növekedés, ez dextróznál lehet jóval több idő is (1-2 hét).
Ha nem indulna be a növekedés annak több oka is lehet:

• sűrű volt az oldat
• valamilyen vegyszer, pl. hipó akadályozta a növekedést (a H₂O₂ a micélium növekedését nem, a spórák kicsírázását viszont megakadályozza)
• beoltáskor az oldat még túl meleg volt , meg kell várni míg teljesen lehűl.
• ha nagy hőmérsékleten, például kuktában történt az oldat sterilizálása a benne lévő cukor karamellizálódhat, ami így már nem alkalmas tápanyagforrásnak.

A mézes LC készítése lépésekben

Célszerű több kicsi “mester” kultúrával kezdeni, a sikeres, fertőzésmentes kultúrákat könnyen tovább lehet oltani egy-egy újabb, nagyobb mennyiségű tápoldatba.

Azért kell több vízzel kezdeni, mert a mikrózás közben valamennyi mindenképp elpárolog.

Befőttesüveg helyett egy jól záródó műanyagdoboz is használható, így az egész sterilizálási folyamat a mikróban folyhat.

Kuktázni egyébként nem ajánlott, mert a cukor magas hőmérsékleten karamellizálódhat.
Nagyüzemi gombakultúráknál a leendő táptalajból is hozzáadnak az LC-hez, tehát ha később búzaszemeket szeretnének vele oltani, akkor még sterilizálás előtt a tápoldathoz adnak egy kis búzalisztet, egy minimális mennyiséget (negyed csipet). Ettől a kolóniák már az LC-ben elkezdik termelni azokat az enzimeket, amik majd a leendő táptalaj lebontásához is szükségesek lesznek, így talán valamivel gyorsabb, egyenletesebb kolonizálás érhető el.

Vákuum

Sterilizálás után egy zárt befőttesüvegben vákuum keletkezik, ami a beoltásnál gondot okozhat, ugyanis a tű beszúrásakor a vákuum egyszerre beszippantja a fecskendő egész tartalmát, vagy ha spóraporral vagy gombadarabbal történne az oltás, ezek bejuttatásához ki kell nyitni a befőttesüveget, és ha a nyitás nem egy tiszta levegőjű helységben (glovebox) történik, beszippanthatja a környezetében lebegő fertőzéseket.

Ha forralás közben a fedő csak lazán van rátekerve, és csak később szorítjuk rá, mikor már valamennyire kihűlt, a vákuum kialakulása elkerülhető.
Egy másik megoldás az airport használata, megint egy másik megoldás ha a oltó fecsibe csak annyi oltóanyag kerül amennyi az LC -be van szánva.

A vákuumot biopsziával való oltásnál jól ki lehet használni, becuppantja a tűben ragadt gombadarabokat.
Fontos még, hogy miután kiegyenlítettük a vákuumot rázzuk meg jól az üveget 5-10 másodpercig. Ezzel a micéleum növekedéséhez fontos oxigént juttatunk vissza a vízbe, ami forralás következtében eltávozott belőle.

Karamellizáció

A karamellizáció a cukor oxidációja, hevítés, jelen esetben főzés közben következhet be. Ez a folyamat felelős a cukor barna elszíneződésért és jellegzetes aromáért. A karamellizálódott cukor gátolja a micélium fejlődést úgyhogy a túlfőzött vagy túlhetvített, megbarnult tápoldatok nem alkalmasak LC készítéséhez. Ez az egyik ok amiért nem kuktázunk LC-t vagy agar-agart, a mikró vagy a főzés bőven elég a sterilizációjukhoz és a túlhevülés sem következik be egykönnyen.

• Fruktóz – 110° C°, 230° F
• Glükóz – 160° C°, 320° F
• Maltóz – 180° C°, 356° F
• Szukróz – 160° C°, 320°F

Lehetőségek

A kész tápoldatot többféleképp be lehet oltani, a szokásos steril eljárásokat betartva.

• Spóraporral – ugyanúgy bele kell kaparni a spóraprintet mintha spórás vizet készítenénk. Pár szem spóra is elegendő egy kultúra indításához, így a “láthatatlan” printekkel is jól működik.

• Spóraoldattal – a spóraporral szemben az az előnye, hogy a beoltáshoz nem kell kinyitni oltáskor az LC-t.

Csak beszúrni az alkohollal letörölt szilikon porton a lánggal sterilizált tűt, és egy-két csepp maradék spóraoldat is elég ahhoz hogy 3 nappal később 1dl elő kultúra válhasson belőle.

• 

  Egy steril vízzel (vagy tápoldattal) töltött fecskendő tűjével átdöfve kész a biopszia. Ugyanúgy lehet vele oltani mintha spóraoldat lenne. (Minimum 18-as tű ajánlott)

  LC-vel – egy fertőzésmentes LC-t mindig célszerű továbboltani egy újabba, megkétszerezve (vagy többszörözve) ezzel a mennyiségét.

• Termőtest- vagy micélium darabbal– A sterilitás szempontjából célszerű biopsziás módszerrel oltani. Ha termőtest volt az alany, az LC “klón” lesz, a vele beoltott médiumon csupa egyforma (legalábbis nagyon hasonló) termőtest fog nőni.(További infók:Oltóanyagok)

Inkubáció, gondozás

A beoltott LC-t célszerű 2-3 napra békén hagyni, egy sötét, meleg (26-30 fokos), hőmérséklet ingadozás mentes helyen. Egy két naponta fel lehet rázni, ha a növekedés nem indulna meg.
Ha a spórák kikeltek, amik pici úszó gombafonalak vagy labdácskák formájában fognak megnyilvánulni, vagy ha a gombadarabok kibolyhosodtak, célszerű valahogy felaprítani a micéliumot, mivel az így keletkezett sok kis darab fonál egy-egy külön kis kolóniává fogja kinőni magát.

A micéliumnak ha folyadékban van szokása egy csomóba gyűlni amit aztán elég nehéz tűvel felszívni mikor már a használatára kerülne a sor. Ezért is ajánlott legalább 18-as (rózsaszín) tűt használni mert a kisebbek könnyen eltömődhetnek. Ha ez történne többször fel kell szívni, és ki kell nyomni az LC-t a tűn keresztül.

Ezért szokás az LC-be rakni valamit, például üveg golyót, üveg darabokat, vagy újabban mágneses keverőhöz használt keverőrudat. (Mindenképpen olyan anyag kell, ami nem rozsdásodik és van éle, vagy éppen gömbölyű)

Ezekkel együtt az LC-t összerázva, könnyebb kisebb darabokra szabdalni azt, és a gombafonál egyébként is szereti az ilyenkor oxigénnel feldúsult vizet.

(ezért se legyen soha tele az üveg a folyadékkal, kell egy kis hely a levegőnek is benne.)

Úgyhogy nem árt néha rázogatni, főleg mielőtt egy fecskendőt töltenénk meg vele.
A mágneses keverő is hasznos és egyszerűen elkészíthető szerkentyű, csak egy számítógép ventilátor, egy winchesterből kiszedett mágnes és egy villa foka kell hozzá.

Mikor már elég kultúra gyűlt össze a befőttesüvegben (1-3 hét után már jelentősen lelassul a növekedés) érdemes hűtőben tárolni, és időközönként tovább oltani egy új tápoldatba, így gyakorlatilag évekig is életképes maradhat.

A fertőzések elkerülése végett hozzá lehet adni pár csepp H2O2-t. Ez a micéliumra még nincs káros hatással, de a tápoldatba bekerülő, esetleg ott megbúvó fertőzéseket elpusztíthatja, de azért érdemes csínján bánni vele.

Hűtőben kb. fél évig életképes marad.

Fertőzések

Az LC-k nagy hátránya hogy nem lehet rajtuk egyértelműen látni hogy fertőzöttek-e, főleg a mézesnél van ez így.

A víz felszínén úszó dolgok, a zavaros víz, vagy a fátyolszerű micéliumtömeg többnyire fertőzésnek a jele, de ez csak akkor derül ki -és sajnos akkor sem egyértelműen- ha már oltottak vele.

Legalább 2-3 táptalajt is be kell oltani ugyanazzal az LC-vel, és ha mind elfertőződik nagy valószínűséggel az LC is fertőzött volt, de ki kell zárni minden más fertőzés forrást, például a táptalaj elégtelen sterilizálásából adódó, vagy az oltásnál bekövetkező fertőzéseket.

Ha fertőzött meg kell szabadulni tőle. Az elvetemültebbek próbálkozhatnak még gyenge H2O2 vagy akár hipó hozzáadásával, a tudományosak agar agaron való izolálással, a türelmesebbje meg várakozással, mivel egy kis szerencsével a békén hagyott micéliumkultúra, -ha olyan fertőzésről van szó- túlnőheti azt.

De sokszor egyszerűbb csinálni egy újat.

Rozsdás LC: Ha esetleg nem rozsdamentes fémdarabot használtál a mágneses keverőhöz, hamar elszíneződik a micéliumfelhő. Ez az elszíneződés nem feltétlenül fertőzés, de ha esetleg mégis beteg, akkor nagyon nehezen észlelhető! Ilyenkor célszerű minél hamarabb átoltani egy újabb LCbe, gabonára vagy sütibe.

Mivel az agar agar után az LC van legjobban kitéve a fertőzéseknek (főleg a készítése közben) egyszerre többet készítve növelhető a valószínűsége, hogy legalább egy fertőzésmentes lesz.

Ezzel aztán már számtalan telepet létre lehet hozni, és mesterkultúraként használható.

Mester kultúrák

A mesterkultúrából elég pár mili litert elhasználni néhány teszt PF sütihez – és ha ezekből kiderül, hogy tényleg fertőzésmentes, – akkor másik 10 LC beoltásához

LC-vel LC-t (szilikon porton keresztül) elég biztonságosan lehet oltani, úgyhogy ezt a 10 LC-t nyugogtan lehet további táptalajok beoltására használni, a mesterkultúrát pedig elég csak akkor elővenni, ha az LC-k fogytán vannak, akkor is csak egy újabb csapat LC előállításához.

Így az első sikeres kultúra fertőzés szempontjából is nagyobb biztonságban lesz – a kevés használat miatt -, és a sikeres sejtosztódások korlátozott száma miatti elöregedés sem történik meg olyan hamar. Hiszen az a 10 darab LC, amihez elég kb 2ml a mesterből, mindig második generációs lesz.

Ha az első LC-vel beoltott második LC-vel beoltott harmadik LC-vel beoltott negyedik LC-vel …stb beoltott kultúrát használná fel valaki, az már a számtalan sejtosztódás miatt eléggé degradált kultúrát hozna csak létre.
Egy mester kultúra fél-egy évig is simán elállhat, hosszabb távra érdemes pár mililiterrel sima desztillált vizet beoltani, és így tárolni.

Így akár évekig is elállhat.

LC készítése spawnból vagy sütiből

A készítés menete a fahtty TEK ben.

Segédlet

Ha valaki pontosabban meg szeretné közelíteni az optimális 4%-os arányt:

• 1ml víz = 1g
• 10ml méz = kb 14g
• 1 kiskanál méz (5 ml) = 7 g
• 1 Csapott teáskanál dextróz 3.1 g

Hozzá kell még tenni, hogy a méz kb. 17%-a víz.

Egyszerű és működőképes recept:

• 200ml desztillált víz
• 8g bio nádcukor

spóraszuszpenzióval oltva kb 3 nap alatt beindul a folyamat és már látszik néhány hifaszál.

• 1ml deszt.víz = 1g

•  ?ml víz * 0.04 = ?g cukor szükséges

azaz

200ml víz * 0.04 = 8g cukor

ha nagyon pontos akarsz lenni, akkor vissza számolod a cukor súlyát a vízből, de ez a pár ml nem számít.

Ha ugyanazon genetikát oltunk azonos időben, más-más cukorkombinációt tartalmazó oldatba, jól láthatóvá válik a cukrok használhatósága közti különbség. Így könnyen kiválaszthatjuk a számunkra megfelelő tápanyagot. A kép oltás után 3 héttel készült. Jól látszik, hogy a tiszta szőlőcukrot tartalmazó üvegben lassabb a micélium fejlődése. Mindegyik oldat a szőlőcukoréhoz hasonló tisztaságú, jól látható az esetleges fertőzés vagy zavarosság. A képen látható oldatok nem tartalmaznak lisztet(a kolonizálandó táptalaj anyagát pl. rozsliszt) se fémdarabkát a mágneses keverőhöz, de mindkettőt érdemes használni. Lisztből nagyon kicsi mennyiséget szoktak hozzáadni, több literhez is max egy késhegynyit, csak hogy a micélium felkészüljön a köztes vivőanyag feldolgozására.

Források

http://www.shroomery.org/9145/Liquid-Culture-Basics http://www.shroomery.org/forums/showflat.php/Cat/0/Number/5874305/an/0/page/0 http://forums.mycotopia.net/glossary.php?do=listglossary&c=3